Презентация на тему: Хромосомные аномалии в эмбриональных стволовых клетках человека hESM01-04

СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУКИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИПрохорович Мария Александровна Хромосомные аномалии в эмбриональных стволовых клетках человека hESM01-04Научный руководитель д. б. н. Рубцов Николай Борисович Новосибирск – 2008

Цель работы: оценить стабильность кариотипа эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека в процессе культивирования и определить характеристики, по которым ЭСК с выявленными хромосомными перестройками отличаются от клеток исходных линий.

Задачи: провести цитогенетический анализ эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека четырёх линий – hESM01, hESM02, hESM03 и hESM04 – в процессе культивирования;2) провести молекулярно-цитогенетический анализ состава и организации выявленных перестроенных хромосом;3) получить и охарактеризовать дифференцированные клетки из ЭСК с нормальным кариотипом, а также из ЭСК, несущих выявленные аномальные хромосомы; 4) провести сравнительный анализ характеристик ЭСК исходных линий hESM01-04 и ЭСК, несущих аномальные хромосомы;5) разработать метод одновременной визуализации и идентификации хромосомных территорий перестроенной хромосомы и её нормального гомолога в трёхмерном пространстве интерфазного ядра ЭСК, несущих выявленные аномальные хромосомы;6)провести оценку влияния хромосомных перестроек на положение хромосом в интерфазных ядрах ЭСК, несущих выявленные аномальные хромосомы.

Общий вид колонии hESM01 Результаты иммуноокрашивания дифференцированных клеток с помощью антител против CD105 (a), пролил-гидроксилазы (б);ядра окрашены DAPI – синий цвет. Фибробластоподобные производные клеток hESM01

Сублиния hESM01r18. 46, ХХ, r(18) Сублиния hESM03der9. 46, XX, del(4),der(9) Иммуноокрашивание клеток hESM01r18.На фотографиях «а» и «б» представлены фрагменты колоний.а – Tra-1-60 – красный сигнал, ядра окрашены DAPI – синий цвет;б – OCT4 – зелёный сигнал.

Реорганизация хромосомы 18 в клетках сублинии ESM01r18 FISH теломерной ДНК пробы с хромосомами клеток сублинии ESM01r18 FISH микродиссекционной ДНК пробы der(18) с хромосомами клеток сублинии hESM01r18

Реорганизация хромосомы 18 в клетках сублинии ESM01r18 FISH микродиссекционной ДНК пробы der(18) c метафазными хромосомами лимфоцитов взрослого человека с нормальным кариотипом

Реорганизация хромосомы 18 в клетках сублинии hESM01r18 FISH микродиссекционной ДНК пробы der(18) с хромосомами клеток сублинии hESM01r18

FISH микродиссекционной комбинированной ДНК пробы del(4)а - с хромосомами клеток сублинии hESM03der9;б - с хромосомами лимфоцитов здорового донора (фрагмент пластинки).

Реорганизация хромосомы 9 в клетках сублинии hESM03der9 Схема микродиссекции нормальной хромосомы 9 и der(9) для получения хромосомоспецифичных проб WCP9 и WCPder(9), а также районоспецифичных проб PCPder(9)-p, PCPder(9)-1, PCPder(9)-2 и центромерной пробы PCPC

Реорганизация хромосомы 9 в клетках сублинии hESM03der9 FISH хромосомоспецифичной WCPder(9) (красный цвет) и прицентромерной PCP9C (жёлтый цвет) микродиссекционных ДНК проб с хромосомами клеток сублинии hESM03der9.

Визуализация и идентификация хромосомных территорий хромосомы 18 и её деривата FISH c хромосомами клеток сублинии hESM01r18 ДНК пробы, приготовленной на базе клонированного фрагмента ДНК из района делеции. Совместная 3D FISH ДНК пробы, маркирующей нормальный гомолог хромосомы 18, и хромосомоспецифичной пробы WCP18, окрашивающей хромосомные территории хромосомы 18 и её деривата. Ядра окрашены DAPI – синий цвет.

Трёхмерная реконструкция хромосомных территорий хромосом 18 и r18 в ядрах клеток hESM01r18 Совместная 3D FISH ДНК пробы, маркирующей нормальный гомолог хромосомы 18, и хромосомоспецифичной пробы WCP18, окрашивающей хромосомные территории хромосомы 18 и её деривата. Ядра окрашены DAPI – синий цвет.

Локализация хромосомных территорий хромосом 18 и r(18) в клетках сублинии hESM01r18

3D реконструкция хромосомы 9 и её деривата в пространстве интерфазного ядра клетки сублинии hESM03der9 3D FISH хромосомоспецифичной WCPder(9) (зелёный цвет) и прицентромерной PCP9C (красный цвет) ДНК проб с ядрами ESM03der9.

Выводы (первая часть) Получены две сублинии ЭСК, отягощённые хромосомными перестройками, в то же время показано, что при проведении регулярного мониторинга состояния кариотипа возможно проведение длительного культивирования клеток hESM01-04, не сопровождающееся тотальной дестабилизацией кариотипа. Детально охарактеризованы выявленные аномальные хромосомы, являвшиеся производными хромосом 4, 9 и 18, с помощью полученного комплекта микродиссекционных проб.3) Показано, что, несмотря на сохранение «маркёров плюрипотентности», способности к дифференцировке ЭСК, отягощённых выявленными хромосомными аномалиями, снижены по сравнению с клетками исходных линий hESM01-04.

Выводы (вторая часть) 4) Разработан метод одновременной визуализации и идентификации хромосомных территорий хромосомы 18 и её деривата в клетках hESM01r18, хромосомы 9 и её деривата в клетках hESM03der9.5) На примере хромосомных территорий хромосом r18 и её нормального гомолога показано, что хромосомная перестройка сопровождалась изменением локализации перестроенной хромосомы по сравнению с локализацией её нормального гомолога относительно периферической области ядра и ядрышек. На примере аномалии хромосомы 9 в клетках hESM03der9 и их дифференцированных производных показано, что дуплицированный район, содержащий последовательности, гомологичные прицентромерным повторам, локализуется предпочтительно в периферической области ядра, также как и прицентромерные районы хромосом 9 и её деривата.

Спасибо за внимание!

3D реконструкция хромосомы 9 и её деривата в пространстве интерфазного ядра клеток сублинии hESM03der9 3D FISH хромосомоспецифичной WCPder(9) (зелёный цвет) и центромерной PCP9C (красный цвет) ДНК проб с ядрами hESM03der9.

Локализация трёх районов хромосомных территорий хромосом 9 и der(9) в клетках hESM03der9 и их дифференцированных производных Обозначение районов хромосомы 9 и её деривата.9N - прицентромерный район хромосомы 9,9С – прицентромерный район хромосомы der(9),dup9 – дополнительный сигнал на хромосоме der(9).Хромосомы окрашены красным, сигналы жёлтым. Один из вариантов локализации районов dup9, 9С и 9N в ядрах клеток hESM03der9 и в ядрах дифференцированных клеток, полученных на основе hESM03der9.

Варианты локализации части хромосомной территории относительно границы ядра и ядрышка.(С 1) – одной стороной лежит в периферической области ядра;(С 2) – двумя сторонами лежит в периферической области ядра; (C nu) – касается ядрышка, (С 1 + nu) – одной стороной касается ядрышка, другая лежит в периферической области ядра; 0 - не касается ядрышка и не лежит в периферической области ядра.Зелёным обозначены варианты локализации части хромосомной территории, красным – ядрышки.

Экспрессия специфических маркёров, выявленная с помощью моноклональных антител Культура клеток. Линия hESM01 Срезы эмбриоидных телец. Линия hESM03

Сравнение свойств клеток сублиний hESM01 и hESM01r18

Сравнение свойств клеток сублиний hESM01 и hESM01r18, hESM03 и hESM03der9

Сублиния hESM01r18. 46, ХХ, r(18) Сублиния hESM03der9. 46, XX, del(4),der(9)